| WB 实验结果有黑点 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 封闭液未溶解完全 | a. 确认奶粉完全溶解。出现黑点最常发生的原因是奶粉没有完全溶解，建议加入搅拌子，增加搅拌时间，或是溶解后离心取上清液使用。 b. 利用0.45 um的滤纸过滤溶液，以除去未溶解的牛奶颗粒及其他杂质。 c. 改变封闭液的种类，如换为BSA。 |
| 溶液污染 | a. 使用新鲜配制的溶液 （跑胶、转膜、封闭、洗脱等缓冲液）或商业化溶液，以减少因长菌长霉造成的黑点。 b. 确认一抗溶液是否保存不当，可尝试重新配置一抗溶液。 |
| 封闭液及抗体交互作用 | 一般脱脂牛奶中含有casein这种磷酸蛋白，可能会与磷酸化抗体产生非特异性结合，因此，如使用磷酸化抗体，建议用BSA作为封闭溶液，同时洗脱溶液也用TBST，如此可降低黑点或高背景值状况。 注：a. TBST是以Tris为基底，PBST是以磷酸盐为基底的缓冲液，一般根据习惯选择使用TBST或PBST。但如果是操作磷酸化抗体或最终显色分析是用AP系统时，因为PBST中的磷酸根会干扰，可能会造成高背景值或无信号，此时建议使用TBST缓冲液。另外，同一次实验中请使用一种缓冲液，不可封闭液用PBST，洗脱液用TBST。 b. 封闭时一般使用3-5%封闭溶液，依实验特性不同，可做微调；牛奶与BSA的选择也是相同，掌握原则后，再依实验特性做微调，就能快速上手。 |
| WB实验结果信号过曝 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 蛋白样品过量 | 降低蛋白上样量。通常蛋白上样量为30-50 ug，但有些蛋白的表达量较高（如beta actin），此时可依蛋白表现量，调整上样量。 |
| 抗体过量 | a. 提高抗体稀释倍数。产生过曝时可提高一抗、二抗的稀释倍数。 b. 减少孵育时间 c. 于4℃孵育 |
| 信号过曝 | a. 缩短曝光时间。过曝时可缩短曝光时间，减少过曝的情形。 b. 使用低灵敏度的化学发光底物。过曝现象也有可能是因为化学发光底物过强导致的, 可选用灵敏度较低的化学发光底物来改善。 注：化学发光底物一般有三种等级，femto（飞克, 10-15g）， pico（皮克, 10-12g）, 及plus（低皮克级, 10-12~ 10-9g），可依蛋白表达量挑选适合的化学发光底物。 |
| WB实验结果拖带 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 样本不纯，有杂质污染 | a. 重新离心样品后取上清液使用 b. 使用较纯的试剂配置细胞裂解液或购买商业化产品 c. 使用Benzonase®核酸酶。Benzonase®核酸酶能迅速水解核酸，降低蛋白样品粘度，减少核酸对跑胶的干扰 d. 全细胞或亚细胞萃取。使用商业化全细胞或亚细胞萃取试剂盒提取蛋白样品，减少配制试剂溶液以及操作中分离不干净的问题。 |
| 蛋白样品过量 | a. 降低蛋白上样量。通常蛋白上样量为30-50ug，但有些蛋白表达量较高(如beta actin)，此时可依蛋白表达量，进行微调。 b. 延长加热时间。蛋白变性不完全, 也会使条带成团拖尾，此时可通过延长样品加热时间（一般约5分钟）及调整SDS（一般是2 %）比例, 使蛋白变性更完全。 |
| 信号过曝 | a. 缩短曝光时间。过曝时可缩短曝光时间, 减少过曝的情形。 |
| b. 使用低灵敏的化学发光底物。过曝现象可能是因为化学发光底物过强导致的, 可选用灵敏度较低的化学发光底物来改善。 | |
| WB条带扭曲 | |
| 原因 | 解决方案 |
| 胶没配置好 | a. 确保APS & TEMED 正常, 并新鲜配置胶体。 APS为起始剂，主要负责提供自由基供胶体进行聚合反应， APS粉末容易受潮，建议置于防潮箱保存，如果发生结块，建议重新购买。TEMED为催化剂，如果保存不当或过期，也会影响胶体聚合，建议分装。 b. 小心移除齿梳，避免造成加样壁孔歪斜 c. 配完下层胶后，需用水或醇类将胶体压平 d. 胶里面有杂质/气泡。可预先用0.45 um滤纸过滤胶体溶液，混合胶体溶液时，应避免产生气泡。 |
| 电流电压问题 | a. 避免用高电压电泳使胶体过热。 150V，过热有雾气，80-100V，上胶带短、下层不匀。 b. 空的孔道加样品缓冲液，使每个孔洞都有样品且盐类成分相近。 c. 避免孔洞中有杂质，用高纯度等级的化学药品或用商业化试剂提取蛋白样品，或在上样前用跑胶缓冲溶液冲洗加样孔。 |
| 转膜问题 | a. 胶体应与膜密合，转膜时小心滚压胶体，使胶体与膜贴合紧实 b. 转膜时小心勿晃动。有时出现 2个条带是因为转膜时发生晃动，产生叠影 条带呈哑铃状 出现哑铃最大的可能是胶没有配置好，胶凝固后不均一，拔完梳子之后，某些孔道凸起不平整，可以试着注意胶体是否凝固完全（确认试剂没问题），拔梳子时注意不要让孔道歪掉，loading前也可以再用running buffer冲洗孔道，另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，或没有溶解，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白因此被推挤到两边。 |
| 条带呈哑铃状 | 原因：出现哑铃状最可能是胶没有配制好，胶凝固后不均，拔完齿梳之后，某些孔道凸起不平整，另一种可能是样品中含有过多杂质，没有离心下来，或没有溶解，导致杂质沉积在孔的中间，蛋白因此被推挤到两边。 解决方案：确认胶体是否凝固完全，拔齿梳时注意不要让孔道歪斜，上样前可再用跑胶缓冲液冲洗孔道。 |
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