高灵敏度支原体检测试剂盒说明书
【产品规格】
BPMPro100 100 Reactions/盒
【产品说明】
支原体(Mycoplasma)：目前发现的最小原核生物，据统计约15~35% 的细胞被支原体污染。支原体污染会改变宿主细胞的结构与功能，易致实验结果不稳定，须对培养细胞定期进行支原体检测。
本试剂盒采用双色荧光 qPCR (TaqMan 探针法) 检测支原体DNA。检测对象为细胞培养的上清液，细胞沉淀或其他生物制品。该试剂盒具有以下特点：
灵敏：配合推荐使用的核酸抽提方案，检测灵敏度达到10CFU/ml。
可靠：抽提加入内标核酸，全过程质量控制。
稳定：全程闭管操作，无交叉污染。
方便：操作简单，无需电泳步骤。
【有效期】
规定储存条件下6个月。
-20 ℃取出后，可避光存放于4 ℃继续使用1周。
【产品组分】
表1 产品组分
| 组分名称 | 装量 | 储存条件 |
|---|---|---|
| Biowing® MyqPCR Reaction Mix1 | 475 ul×2管 | -20 ℃，避光 |
| Biowing®MyPrimer&Probe Mix2 | 25 ul×2管 | -20 ℃，避光 |
| 阳性质控（PC) | 50 ul×2管 | -20 ℃ |
| 内部质控（IC) | 50 ul×2管 | -20 ℃ |
| RNase Free Water | 50 ul×2管 | -20 ℃ |
| 石蜡油 | 750 ul×2管 | -20 ℃ |
注：
1、阳性质控含有支原体DNA和内标DNA。
- 内部质控含有内标DNA。
在实验前请完整阅读本说明书，务必重视注意事项和无菌操作规范！
【操作步骤】
1.样本制备
- 样本的标准制备方案：请配合使用高效无微生物污染的DNA抽提试剂盒提取样本DNA。整个过程需要遵守无菌操作规范。本公司目前推荐抽提试剂盒见附录3。直接取20 µL待测样本DNA，作为模板进行 qPCR 反应。
- 前处理阴性样本准备方案：将RNase Free Water当成样本，加入内部质控，进行核酸抽提。
- qPCR 反应液的准备
- 根据所要检测样品的数量，计算所需反应孔数，每个样本做3个重复孔。
反应孔数=1个阳性PCR质控+1个阴性PCR质控+1个前处理阴性质控+样本数× 3 - 根据反应孔数计算所需的qPCR Mix 总量（需有1孔的加样损失量）：
Mix =（反应孔数+1）×10 μl - 各试剂放室温融化，并根据下表所示准备 qPCR Mix：
表2 qPCR Mix的配制
| 组分/样品管 | Biowing® MyqPCR Reaction Mix1 (µL) | MyPrimer&Probe Mix2(µL) | 总体积(µL) |
|---|---|---|---|
| 1人份 | 9.5 | 0.5 | 10 |
| N人份 | 9.5N | 0.5N | 10N |
- 加样
（1）震荡混匀 qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。
（2）向每孔反应管中分装 10 μL qPCR Mix。
（3）向已分装过 qPCR Mix 的反应管中加入15 ul石蜡油。
（4）向反应管中加入样品后短暂离心，加样示例如下：
表 3 加样示例
| PCR模板 | qPCR Mix | 总体积 |
|---|---|---|
| PC 20 μL | 10 μL | 30 μL |
| qPCR 阴性20 μL | 10 μL | 30 μL |
| 前处理阴性20 μL | 10 μL | 30 μL |
| 样本A重复1 20ul | 10 μL | 30 μL |
| 样本A重复2 20ul | 10 μL | 30 μL |
| 样本A重复3 20ul | 10 μL | 30 μL |
【注】：此时每个反应孔的体积为30μL。
qPCR 阴性的PCR模板为20 ul RNase Free Water。
PCR 仪设置以 ABI 7500 为例，相对定量模式，选择
TaqMan 探针法：
| 步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 预变性 | 1 | 94℃ | 5 min |
| 2 | 变性 | 15 | 95℃ | 10 s |
| 退火与延伸 | 65℃ | 90 s | ||
| 3 | 变性 | 25 | 95℃ | 10 s |
| 退火与延伸 | 65℃ | 30 s | ||
| 65℃延伸时收集荧光信号 | ||||
| 通道选择：样本检测通道-FAM；内参检测通道-HEX，无HEX 通道，可使用VIC 通道。ABI 系列荧光定量 PCR 仪需 ROX 校准，Passive reference 选择ROX。 |
注：1、该程序为两阶段扩增法，如荧光定量PCR仪可以两阶段收集荧光，按照正常Ct值判断结果；如果只能最后一步收集荧光，需要在原数据的基础上加15个Ct值。
- ROX设置是以7500为例，但也存在例外，例如StepOne。
【阈值设置】
以ABI 7500 为例，扩增曲线选择 log 法，如果不能两阶段收集荧光，基线设置1~2个循环；如果可以，基线设置3-15个循环。建议用 log 法扩增曲线保证结果稳定可靠。
- 内参(HEX/VIC)阈值设定：以阳性对照定内参扩增曲线阈值，将内参的Ct 值定为 28±2。
- 支原体(FAM)阈值设定：以阳性对照定支原体扩增曲线阈值，将支原体(FAM)的 Ct 值定为 28±2 。
【实验质量控制】：
如果阳性对照管的支原体(FAM)Ct 值>30，但阳性对照管及前处理阴性对照管的内参(HEX)Ct 值正常，表明阳性支原体对照模板有降解。
如果样品前处理阴性的内参（HEX/VIC)Ct 值>30，阳性对照管的内参(HEX)Ct 值>30 ，表明内参DNA存在降解或PCR体系扩增效率下降。
【结果判读】
根据支原体(FAM) Ct 值、内标(VIC) Ct 值判定，具体标准如下：
| PCR 模板 | 支原体(FAM)Ct 值 | 内标(VIC) Ct 值 | 判定说明 |
|---|---|---|---|
| 阳性对照 | ≤30 | － | 阳性成立 |
| >30 | － | 阳性不成立 | |
| qPCR阴性对照 | ≥37.5 | ≥37.5 | 阴性成立 |
| ＜37.5 | ＜37.5 | 阴性不成立 | |
| 样本前处理阴性 | ≥37.5 | ≤30 | 阴性成立 |
| 待测样品反应孔 | ＜37.5 | ≤30 | 阳性 |
| ≥37.5 | ≤30 | 阴性 |
要求每个检测样品做3重复，如果3复孔中，两重复为阳性，则判读为阳性；建议做样本前处理阴性，可以质控整个抽提过程。
注：检测结果异常时：
- 样品前处理阴性：内参Ct值过大，表明抽提效率低；支原体检测通道Ct值小于37.5，可能前处理抽提过程存在污染。
- qPCR阴性：支原体和内参检测通道Ct值小于37.5，操作过程存在污染。
- 样本前处理阴性质控和PCR阳性质控内参差1±1个Ct值属于正常现象。
【 PCR过程注意事项】
由于 PCR 反应非常灵敏，实验操作中应注意以下事项，以免发生DNA 污染：
- 试剂盒开启后，阳性质控和内部质控与试剂Biowing® MyqPCR Reaction Mix1、Biowing®MyPrimer&Probe Mix2、RNase Free Water、石蜡油分开存放。
- 每个组分在使用前都应先低速离心后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，并低速短暂离心后使用。
- 要求核酸抽提和qPCR过程都符合无菌操作规范。
- 建议自备转运盒，用于将配制分装好的Mix从配置Mix超净工作台转运到加样超净工作台。
- 建议在 qPCR 反应板上阳性对照的排布应远离待测样本和阴性对照。
- 建议 qPCR 配置与分装在一个无菌操作台，样本的加样在另外一个无菌操作台。
- 建议使用不同的移液器添加阳性对照与待测样本、阴性对照，并使用带滤芯的枪头进行加样。
- 应按照先加阴性，再加样本，最后加阳性的顺序加样。且阳性用专门的加样器。建议阳性在专门的无菌操作台加样。
- qPCR 反应板封膜或盖盖子时须反复压紧。
- 上机扩增前，反应管短时低速离心，将管壁液体收集至管底
- 盖上反应管盖子或者贴上光学膜后，为避免影响荧光信号读取，请注意不要在管盖或者膜上做标记，或者用刮板反复摩擦。
- 本产品仅作科研用途。
【附录 1 可检测支原体种类】
| 序号 | 拉丁文系统名 | 序号 | 拉丁文系统名 |
|---|---|---|---|
| 1 | Acholeplasma hippikon | 46 | Mycoplasma orale |
| 2 | Acholeplasma laidlawii | 47 | Mycoplasma ovipneumoniae |
| 3 | Acholeplasma oculi | 48 | Mycoplasma oxoniensis |
| 4 | Acholeplasma pleciae | 49 | Mycoplasma penetrans |
| 5 | Candidatus Mycoplasma girerdii | 50 | Mycoplasma phocicerebrale |
| 6 | Mycoplasma alkalescens | 51 | Mycoplasma phocidae |
| 7 | Mycoplasma alvi | 52 | Mycoplasma pirum |
| 8 | Mycoplasma anseris | 53 | Mycoplasma pneumoniae |
| 9 | Mycoplasma anserisalpingitidis | 54 | Mycoplasma pulmonis |
| 10 | Mycoplasma aquilae | 55 | Mycoplasma salivarium |
| 11 | Mycoplasma arginini | 56 | Mycoplasma sp. Phocoena |
| 12 | Mycoplasma arthritidis | 57 | Mycoplasma sphenisci |
| 13 | Mycoplasma auris | 58 | Mycoplasma struthionis |
| 14 | Mycoplasma bovoculi | 59 | Mycoplasma sualvi |
| 15 | Mycoplasma buccale | 60 | Mycoplasma subdolum |
| 16 | Mycoplasma canadense | 61 | Mycoplasma synoviae |
| 17 | Mycoplasma cloacale | 62 | Mycoplasma testudineum |
| 18 | Mycoplasma conjunctivae | 63 | Mycoplasma testudinis |
| 19 | Mycoplasma crocodyli | 64 | Mycoplasma timone |
| 20 | Mycoplasma dispar | 65 | Mycoplasma todarodis |
| 21 | Mycoplasma elephantis | 66 | Mycoplasma tullyi |
| 22 | Mycoplasma enhydrae | 67 | Mycoplasma verecundum |
| 23 | Mycoplasma equigenitalium | 68 | Mycoplasma vulturii |
| 24 | Mycoplasma falconis | 69 | Mycoplasma zalophi |
| 25 | Mycoplasma faucium | 70 | Mycoplasmopsis agassizii |
| 26 | Mycoplasma felis | 71 | Mycoplasmopsis alligatoris |
| 27 | Mycoplasma flocculare | 72 | Mycoplasmopsis anatis |
| 28 | Mycoplasma gallisepticum | 73 | Mycoplasmopsis arginini |
| 29 | Mycoplasma gateae | 74 | Mycoplasmopsis bovirhinis |
| 30 | Mycoplasma genitalium | 75 | Mycoplasmopsis canis |
| 31 | Mycoplasma gypis | 76 | Mycoplasmopsis citelli |
| 32 | Mycoplasma hominis | 77 | Mycoplasmopsis columbinum |
| 33 | Mycoplasma hyopharyngis | 78 | Mycoplasmopsis cricetuli |
| 34 | Mycoplasma hyorhinis | 79 | Mycoplasmopsis cynos |
| 35 | Mycoplasma hyosynoviae | 80 | Mycoplasmopsis edwardii |
| 36 | Mycoplasma imitans | 81 | Mycoplasmopsis felis |
| 37.5 | Mycoplasma indiense | 82 | Mycoplasmopsis fermentans |
| 38 | Mycoplasma leocaptivus | 83 | Mycoplasmopsis gallinacea |
| 39 | Mycoplasma leonicaptivi | 84 | Mycoplasmopsis mustelae |
| 40 | Mycoplasma lipophilum | 85 | Mycoplasmopsis pullorum |
| 41 | Mycoplasma marinum | 86 | Mycoplasmopsis pulmonis |
| 42 | Mycoplasma moatsii | 87 | Mycoplasmopsis verecunda |
| 43 | Mycoplasma mobile | 88 | Ureaplasma diversum |
| 44 | Mycoplasma nasistruthionis | 89 | Ureaplasma felinum |
| 45 | Mycoplasma neophronis | 90 | Ureaplasma urealyticum |
【附录 2 适用荧光定量 PCR 仪品牌型号】
| 序号 | 生产商 | 机器型号 |
|---|---|---|
| 1 | ABI | 7500 |
| 2 | ABI | 7500 Fast DX |
| 3 | ABI | StepOnePlus |
| 4 | ABI | QuantStudio5 |
| 5 | ABI | StepOne |
| 6 | ABI | QuantStudio7 |
| 7 | ABI | VIVA7 |
| 8 | ABI | QuantStudio 3 |
| 9 | Roche | Roche LightCycler96 |
| 10 | Roche | Roche LightCycler480 |
| 11 | Biorad | Bio-Rad CFX96 |
| 12 | 宏石 | SLAN-96S/48P |
注：适用荧光定量PCR 仪为迄今为止我们客户配备的定量仪器品牌型号，如您的荧光定量 PCR 仪不在我们列出的范围，也欢迎联系我们，申请试用。
如有技术问题，欢迎电话咨询：021-33559491
【附录 3 高灵敏度支原体 DNA 提取纯化试剂盒（柱式法）说明书】
本公司推荐QIAGEN公司的QIAamp UCP Pathogen Mini Kit (50)
货号： 50214
- 试剂盒简介
支原体 DNA 提取纯化试剂盒（柱式法）用于提取纯化生物样品中的微量支原体 DNA，与高灵敏度支原体检测试剂盒（PCR-荧光探针法）配套使用，参照EP2.6.7 和 JPXVII 支原体检测相关要求进行验证。 - 试剂盒组分
表 1. 试剂盒组分
| 组份 | 装量 | 储存条件 |
|---|---|---|
| Collection Tubes (2 ml) | 50个×1 袋 | 室温 |
| Elution Tubes (1.5 ml) | 50个×1 袋 | 室温 |
| UCP Mini Columns | 1个×50 | 2~8℃ |
| Buffer ATL | 38ml×1 瓶 | 室温 |
| Buffer APL2 | 14ml×1 瓶 | 室温 |
| Buffer APW1 | 18ml×1 瓶 | 室温 |
| Buffer APW2 | 15ml×1 瓶 | 室温 |
| Buffer AVE | 1.9ml×8管 | 室温 |
| Proteinase K | 2.5ml×1 瓶 | 2~8℃ |
注：在室温(15-25℃)下储存，蛋白酶K可稳定达1年。延长蛋白酶K的寿命，建议储存在2-8℃。
在实验前请完整阅读本说明书，务必重视注意点！
- 实验准备
开启新试剂盒时需完成以下工作： - 将样品置于室温(15–25°C)平衡。
- 将Buffer AVE置于室温平衡。
- 配制Buffer APW1：使用前，将24 ml乙醇(96-100%)加入18 ml Buffer APW1浓缩液中，得到42 ml Buffer APW1。加入乙醇后震荡混匀。
- 配制Buffer APW2 ：使用前，将35 ml乙醇(96-100%)加入15 ml Buffer APW2浓缩液中，得到50 ml Buffer APW2。加入乙醇后震荡混匀。
- 如果Buffer ATL或Buffer APL2中形成沉淀，应56 ℃水浴或金属浴，待完全溶解后，震荡混匀。
- 准备好 2个水浴或金属浴温度，56 ℃、70 ℃。
在样品准备时需要注意以下几点： - 阴性对照（NCS）：每次实验中都需要用稀释液设置一个 NCS 作为对照样品，NCS 与其他待测样品一起进行 DNA 的提取和纯化操作，以评估在样品处理过程中各操作步骤是否正确，是否存在样品交叉污染或环境污染的情况。
制备步骤如下：取 1.5 ml 无菌低吸附离心管，加入400μl无菌水，再加入6 μl IC，混匀。 - 待测样品：在提取支原体样品之前将 IC 添加到样品中，可以作为整个实验过程的质控。制备步骤如下：取 1.5 ml 无菌低吸附离心管，加入 400 μl 样品，再加入 6μl IC，混匀。
- 样品处理
根据样品的体积不同分为两种不同的方式进行处理：对于小于 400 μl 样品不需要浓缩，直接进行后续的 DNA 提取纯化实验；对于大体积（400 μl~2 ml）的样品应先离心浓缩至 400 μl，再进行后续的 DNA 提取纯化实验。具体方法步骤如下：
1、小体积样品（≤ 400 μl）
取 400μl 样品（细菌小于2×109或细胞小于5×107）于 1.5 ml 无菌低吸附离心管中。
2、大体积样品（400 μl~2 ml）
根据是否需要检测样品细胞中的支原体情况，可以选择离心浓缩方式进行：
离心浓缩
- 取离心去除细胞后的上清，于 4 ℃ 15000 rpm 离心 30min，沉淀支原体颗粒。
- 离心后，小心用移液枪缓慢吸出上清。注意吸取速度不可太快，枪头不可触碰支原体沉淀颗粒。切忌采用直接倾倒的方式去除上清，以免造成损失。
- 加入 400 μl ATL，用移液枪吹打或涡旋重悬支原体沉淀，并轻微离心， 将管壁等上面的液滴离心下来。
- 将上述重悬液转移至 1.5 ml 无菌低吸附离心管中。
注意样品预处理好后需尽快进行下述的DNA 提取实验
操作过程
- 在400μl已预处理的样品中加入6ul 内部质控DNA、40μl蛋白酶K（Proteinase K），涡旋震荡10秒以充分混合。
- 56°C孵育样品20分钟。
- 加入200μl Buffer APL2，关上管盖涡旋振荡30秒。（注意：为了确保足够的裂解，必须将样品和缓冲液APL2充分混合。）
- 70°C孵育20分钟。
- 瞬时离心将管壁上的液滴流回管底。
- 加入300 μl乙醇。关上管盖，涡旋振荡15-30秒以充分混匀。
- 小心的吸取600 μl步骤6中的液体，转移至QIAamp UCP Mini spin column（放在2ml的收集管中），注意不要弄湿吸附柱上缘。关上管盖，6000 x g (8000 rpm)离心1分钟。把吸附柱转移到一个新的2ml收集管中，弃去旧的收集管。
- 将步骤6中剩余的液体加入吸附柱，重复步骤7。
- 在吸附柱内小心的加入600μl Bufffer APW1，注意不要弄湿吸附柱上缘。关上管盖，6000 x g (8000 rpm)离心1分钟。把吸附柱转移入一个新的2ml收集管，弃去旧的。
- 小心的打开吸附柱盖，加入750μl Buffer APW2，注意不要弄湿吸附柱上缘。关上管盖，用最大离心速度（20000 x g；12000rpm）离心3分钟。
- 建议步骤：将吸附柱放入一个新的2ml收集管，弃去旧的。以最大速度离心1分钟。这一步有助于去除buffer APW2的残留。
- 将吸附柱放入一个新的2ml收集管，打开管盖，56°C加热3分钟使膜充分干燥。
- 将吸附柱放入一个干净的2ml收集管中，弃去旧的收集管。小心的在吸附柱膜中央加入35μl Buffer AVE。关上管盖，室温孵育1分钟。
- （注意：确保Buffer AVE平衡到室温。如果以小体积(<50 μl)进行洗脱，则必须将Buffer AVE加到膜的中心，以完全结合DNA。洗脱体积可根据下游应用的要求进行调整。回收的洗脱液体积，比加在column上的洗脱液体积少5 μl。）
- 以最大离心速度（20000 x g ； 12000 rpm）离心1分钟，洗脱核酸。
- 重复步骤13和14。
注：洗脱体积为70ul
核酸抽提注意事项
- 请尽量在完成样品纯化处理当天进行后续的 DNA 检测，以保证检测结果的准确性。
- 由于支原体为病原微生物，提取纯化操作过程建议在二级生物安全实验室或安全柜中进行。
- 不要将漂白剂或酸性溶液直接添加到含有缓冲APL2或缓冲APW1。如果含有这些缓冲液的液体溢出，用合适的实验室洗涤剂和水清洗。如果溅出的液体含有潜在的传染因子，先用实验室洗涤剂加清水清洗，再加1% (v/v)次氯酸钠清洗。
样品制备期间: - 小心地将样品溶液加到核酸吸附柱上。枪头中的样品进入核酸吸附柱而不湿润柱的边缘。
- 不同液体在转移之间更换枪头。使用带滤芯的枪头
- 避免用枪头接触核酸吸附膜。
操作环境及相关设备耗材 - 实验所需但试剂盒中未含材料
- RNase Free Water
- 无水乙醇（分析纯）
- PCR 8 连管或 96 孔板，相应管盖或覆膜
- 1000μl，100μl，10μl 无菌低吸附滤芯枪头
- 1.5ml，2ml 无菌低吸附离心管
- 相关设备
- 迷你离心机
- 漩涡振荡器
- 恒温水浴锅或金属浴锅
- 1000μl，100μl，10μl 移液枪
- 荧光定量 PCR 仪
- 生物安全柜
无菌操作规范
1、除高速离心机外，其他设备和耗材应放在无菌操作台中，保证无菌。
2、样本高速离心后，要对离心管喷酒精，并用棉球擦拭离心管外壁，同时更换干净的板架和新手套。
3、实验前用75%酒精擦净台面及四周，放好需用的实验器材及各种溶液，并用酒精棉球擦拭，更换干净的管架。
4、对着桌面，空间喷洒酒精，然后将超净工作台通风机打开，超净工作台和紫外灯打开 30～45 分钟，再将无菌室紫外灯打开 30～45 分钟后关闭，再通风 15 分钟。关闭紫外，拉开小一半隔离，用酒精棉球擦拭超净工作台桌面2遍，关上隔离。
5、进入无菌室操作前，双手及在操作台内手臂部分用75%的酒精擦拭消毒。穿专用工作服、帽及拖鞋、口罩，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。
6、无菌室温度宜控制在 18～28℃，湿度在 45%～65%（温湿度计应该用无水的）。
7、从枪头盒中取出枪头时，尖部不能触及外露部位及离心管和管架边。
8、操作尽量在酒精灯前操作。打开离心管前，酒精灯灼烧镊子，待冷却后用镊子开关管盖。
9、操作中，不能在样品上方翻转瓶盖，袖口不能掠过样品上方。
10、实验完毕，清洁台面。
11、实验者在实验后用肥皂清洗双手。
12、换下的专用实验服，进行紫外线，一次性鞋套额帽子扔进垃圾桶。
13、用毕，再开紫外灯消毒 30分钟。
14、无菌室和缓冲间定期大扫除，保持整洁。
15、定期检查紫外灯灯管。每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。如灯管发黑，超过使用期限，及时更换紫外灯管。
2、注意事项
(1)工作台面上，禁止存放不必要的物品，以保证工作区域内的洁净气流不受干扰。
(2)禁止在工作台面上记录，工作时应尽量避免作明显扰乱气流的动作。(3)根据环境洁净度，每 3~6 个月将中效过滤器中的滤料拆下清洗。一般情况下，当无纺布滤料容纳尘埃较多、表面发黑时即可拆下进行清洗，或者予以更换。
(4)风机转速调至最大时，仍不能达到所需要的风速时（即风速≤0.2m/s）,则必须更换高效空气过滤器。说明书